В маленькой хорошей новости-113 мы рассказывали как в рамках совместной работы с САФУ по клональному микроразмножению клюквы болотной для Архангельской клюквенной плантации Ольга Николаевна Тюкавина, доцент кафедры биологии, экологии и биотехнологии, кандидат сельскохозяйственных наук и ее студенты 14 марта провели ОТБОР растений доноров с маточных участков и поместили их в свою лабораторию.
Несмотря на введение ограничений по карантину и дистанционному обучению основная работа с растениями-донорами продолжалась и будет продолжаться. Подробно об этом рассказано в статье по клональному микроразмножению клюквы, которую написала дипломница направления Биотехнология Анна Балуева в сборник студенческих работ САФУ.
Мы поздравляем Анну с успешной защитой диплома и считаем, что ее статья достойна публикации на нашем сайте в полном объеме.
ВВЕДЕНИЕ КЛЮКВЫ В КУЛЬТУРУ IN VITRO Балуева А.А. студентка 4 курса высшей школы естественных наук и технологий, научный руководитель:
Тюкавина О.Н., к.с.-х.н., доцент, доцент
Отработана технология введения ягодного кустарничка в культуру in vitro и микроклонального размножения клюквы (Oxycoccus мacrocarpus). Ключевые слова: клюква, кустарнички, микроклональное размножение, стерилизация, состояние покоя, изолированные экспланты, культура in vitro.
Одно из важных направлений в современной биотехнологии в области агротехнологий – это клональное микроразмножение растений. Методику и технологию микроклонального размножения используют, чтобы получить чистый сорт и посадочный материал полностью здоровый, освобожденный от грибков, вирусной инфекции. В самые краткие сроки эта методика позволяет получить большое количество способных к жизни клонированных растений, которые необходимы как для садоводов, так и для промышленности [6].
Будучи успешным методом искусственного вегетативного размножения, микроразмножение имеет ряд преимуществ, а именно:
− только здоровый растительный материал, не имеющий поражений от вирусов, бактерий, грибковых болезней и т.д.;
− преимущественно большое количество экземпляров вегетативного потомства ягодных кустарничков, которые в естественных условиях обитания довольно трудно размножаются;
− круглогодичная лабораторная работа и возможность рассчитать выпуск кустарничков в указанную дату;
− хранить долгое временя растений в пробирках [5].
В качестве объекта исследования взята клюква четырехлепестная, обыкновенная, болотная (Oxycoccus мacrocarpus), которая растет только на сфагновых и осоково-сфагновых болотах, а также в тундре, лесотундре и лесной полосе европейской части Российской Федерации [1]. Помимо этого, клюква сама по себе является ценным лекарственным лесным ягодным кустарничком, богатым биологически активными веществами, такие как, витамин С в большом количестве, который благотворно влияет на иммунную систему человека и повышает защитные функции его организма. Также клюква обладает жаропонижающим, общеукрепляющим и кроме этого противоспалительным действием, что повышает к ней интерес в промышленных масштабах [1, 2, 3, 4, 6, 7].
Цель исследования — введение клюквы в культуру in vitro.
Объектом исследования являлась клюква, отобранная с плантаций ягодного кооператива «Архангельская клюква». Плантации располагаются в Холмогорском районе. Исследования проведены в марте.
Первым этапом работ было выведение кустарничка из состояния покоя. Кустарнички вместе с субстратом отбирали при температуре – 8 °С. Для того, чтобы вывести клюкву из состояния покоя, поместили ее на нижнюю полку обыкновенного домашнего холодильника при температуре +2°С. Через каждые 2 дня повышали температуру в холодильнике на +2 °С до температуры +10 °С. Далее перенесли оттаявшее растение на подоконник и стали ожидать набухание почек (рис. 1). Почки набухли спустя 11 суток после того, как кустарничек клюквы был привезен с кооператива. После этого приступили к введению эксплантатов в условия in vitro.
Рисунок 1. Выведение клюквы из состояния покоя на подоконнике
Процедура введения эксплантов в условия in vitro заключалась в подготовке посуды, приготовлении среды, стерилизации черенков и непосредственно помещение эксплантов на среду в пробирках в стерильных условиях.
Были выбраны два вида сред для более точного эксперимента: среда Андерсона и 1/2 WPM. Эти среды характеризуются меньшим содержанием микро и макроэлементов по сравнению с другими видами сред. Выбор более бедных минеральными элементами сред обусловлен тем, что клюква является олиготрофом, произрастает на кислых бедных болотных почвах. Приготовление питательных сред начиналось с приготовления концентрированных (по-другому их называют маточных) растворов макросолей и микросолей, источников железа и кальция, а также рабочих растворов фитогормонов и витаминов. Из маточных растворов отобрали необходимое количество для приготовления каждой из сред, измерили pH (pH должен быть равен 4,5), добавили агар. Готовые питательные среды разлили по простерилизованным пробиркам на 1/3 объема, закрыли ватными пробками, сверху бумагой. Вместе с пробирками в автоклав ставили две колбы с дистиллированной водой (по 500 мл) для последующей промывки эксплантатов.
Далее работа происходила в ламинар-боксе. Ход работы был следующий. Приступая к работе в боксе, руки, рабочие поверхности ламинара и близкорасположенные предметы протерли 96% спиртом, инструменты обожгли в пламени спиртовки. После стерилизации обжиганием каждый инструмент поместили между листами простерилизованной в автоклаве плотной бумаги. Стерильный инструмент используется только для одноразовой манипуляции. Затем его снова следует простерилизовать спиртом и обжечь. Перед началом работы поместили в ламинар-бокс инструменты, посуду и материалы, необходимые для работы.
Для подготовки экспланта к введению в условия in vitro черенки растения донора промыли в мыльной воде. Мыльную воду получили путем растворения хозяйственного мыла в водопроводной воде. Затем промыли под проточной водопроводной водой в течение 30 минут для того, чтобы смыть полностью все мыло с образца, возможную грязь. По истечению указанного времени отбирали наиболее удачные черенки с набухшими почками и удаляли листья по черешкам. Далее ветви разрезали на более мелкие черенки по междоузлиям. Каждый черенок содержал 2 узла. Черенки стерилизовали в белизне (раствор с водой 1:5) 5 минут. После этого промыли стерильной дистиллированной водой 6 раз (смена воды через 15 минут). Далее отрезали базальную часть черенка на матрасике и переносили на питательную среду. Пробирку закрывали пищевой пленкой (рис. 2,3). В течение 25-30 дней происходит формирование побегов.
Условия культивирования клюквы in vitro создали с помощью лампы для растений с доминированием красного и фиолетового спектра, подключенной к таймеру. Освещенность 1500 Лк., 16 часовой световой день, температура воздуха 20-23 °С.
Рисунок 2. Стерилизация эксплантовРисунок 3. Черенки клюквы, введенные в условия in vitro
Таким образом, осуществили первый этап клонального микроразмножения – выбор растения-донора, изолирование эксплантов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бабикова А.В., Горпенченко Т.Ю., Журавлев Ю.Н. Растения как объект биотехнологии // Комаровские чтения. – 2007. – Вып. LV. – С. 184–211.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. – М.: ФБК-Пресс, 1999. – С. 160.
3. Бутенко Р.Г. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. – М.: Наука, 1991. – С. 278
4. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение растений. – М.: Наука, 1986. – С. 91-102.
5. Катаева Н.В. Клональное микроразмножение растений. – М.: Наука, 1983. – С. 96.
6. Макаров С.С. Разработка технологии клонального микроразмножения лесных ягодных растений и введение их в культуру на выработанных торфяниках. Автореф. дис. к. с.-х.н. – Пушкино, 2019 – 25 с.
7. Шевелуха В.С. Сельскохозяйственная биотехнология. – М.: Наука, 2008 – С. 710.
